國內研究者Cell Research：韓春雨NgAgo有效

11月11日晚上8點左右，Cell Research雜誌以Letter to Editor形式在線發表了來自南通大學和複旦大學研究人員合作完成（該文通訊作者劉東(dong) 博士和作者之一複旦大學王永明研究員）題為(wei) “NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的論文（下圖），該文結果表明 gDNA/NgAgo 係統在斑馬魚中能實現特定基因敲低導致魚眼部發育缺陷，但是不能對靶基因進行基因編輯。

這篇文章中作者的研究的靶基因名為(wei) Fabp11a（Fatty acid binding protein 11a，脂肪酸結合蛋白11a），該基因在參與(yu) 調解葡萄糖和脂代謝穩態方麵具有重要作用，但是在斑馬魚胚胎發育中該基因的功能未知。對此，作者想知道NgAgo係統是否能在斑馬魚中工作，針對Fabp11a基因設計了兩(liang) 條5'-磷酸化的ssDNA（下圖1），與(yu) 優(you) 化過的NgAgo-2nls mRNA一起注射到1細胞期的胚胎中，有趣的是他們(men) 觀察到注射過的胚胎中zui終約有30%會(hui) 產(chan) 生嚴(yan) 重的眼部發育表型。*類表型：眼部有一隻相對小一點的眼睛而另一隻顯得十分小；第二類表型：兩(liang) 隻眼睛融合形成一隻較大的眼睛（見下圖2）。

圖一

圖二

為(wei) 了證明是否斑馬魚出現的表型是由於(yu) Fabp11a基因遺傳(chuan) 突變造成的，作者抽提了正常斑馬魚胚胎和突變斑馬魚胚胎的DNA對靶基因進行PCR擴增，結果測序結果表明靶基因沒有發生任何基因突變，但是通過RT-PCR檢測Fabp11a基因的表達驚奇的發現該基因的表達有顯著敲低（見下圖E）。

為(wei) 了更清楚的說明問題，作者進一步做了一些實排除了單獨由NgAgo-2nls mRNA或者gDNA注射到胚胎導致的表型，而且同時注射NgAgo-2nls mRNA和錯配的gDNA也不會(hui) 產(chan) 生表型，這些實驗結果表明gDNA/NgAgo係統有其特異性。另外實驗結果表明gDNA/NgAgo係統靶向敲低Fabp11a基因導致的斑馬魚眼部的表型可以通過注射Fabp11a mRNA回複表型（見上圖D）。

為(wei) 了進一步確認gDNA/NgAgo係統在斑馬魚中敲低基因是一種普遍的現象，作者又test的另外一個(ge) 基因ta（no tail/ntl or brachyury），結果表明也有大約30%注射過的胚胎出現沒有尾巴的表型（見下圖）。

此前韓春雨NBT文章中表明gDNA/NgAgo係統在人源細胞（37℃）中能夠有效的產(chan) 生11.2%-41.3% 的indels。Cell Res這篇文章中也在37℃的條件下檢測了斑馬魚中gDNA/NgAgo係統是否能產(chan) 生indels，結果表明沒有檢測到任何indels發生。有趣的是在正常情況下，斑馬魚胚胎中注射gDNA和酶活突變的NgAgo mRNA也能產(chan) 生係列表型，當然同樣檢測不到任何indels的發生。為(wei) 了再進一步確認斑馬魚的表型是由於(yu) Fabp11a敲低造成的，作者還做了一些後續的原位雜交實驗，而且還運用CRISPR/Cas9技術敲除Fabp11a基因也能得到相似的表型，當然基因敲除的表型顯然異常劇烈一些，有約10%的胚胎出現眼睛消失的表型。

總的來說，這項研究結果通過使用gDNA/NgAgo係統在斑馬魚中實現了特定基因的敲低，但是沒有檢測到靶基因上任何indels的出現，因為(wei) 酶活突變的NgAgo也能產(chan) 生敲低的效果，作者猜測這個(ge) 係統可能和酶活突變的Cas9：sgRNA係統類似都能在靶基因處抑製基因轉錄。

基因敲低（knockdown）和基因敲除（knockout）的區別

簡單說來，我們(men) 的生命活動基本由蛋白質作為(wei) 機器來完成（RNA 的功能也正在越來越多地被發掘），根據中心法則“DNA-RNA-蛋白質”zui簡化的套路，如果想抑製某個(ge) 蛋白的功能，可以從(cong) DNA、RNA、蛋白質三個(ge) 層麵進行調控。在DNA或者基因組水平的調控是zui*的，基因組編輯（genome editing）即對基因組上的目的基因進行刪除、突變、或插入，曆*沿用至今的常用工具包括ZFN（鋅指蛋白酶）、TALEN 和 CRISPR。在RNA層麵的編輯zui常用的是RNA幹擾，通過抑製RNA的轉錄或者促進RNA的降解從(cong) 而降低RNA水平，影響其翻譯成蛋白質以及相關(guan) 性狀的發生，被稱為(wei) “敲低”（knockdown）。

knockdown（敲低）與(yu) knockout（敲除）是*不同的兩(liang) 個(ge) 概念。基因敲低是將基因表達水平下調，而不涉及靶基因 DNA 本身的變化，基本是不可遺傳(chuan) 的。基因敲除屬於(yu) 基因（組）編輯技術，必須是在基因組水平上造成突變，破壞基因讀碼框，消除整個(ge) 基因的表達。一般來說，在受精卵水平的基因編輯變化能夠穩定地遺傳(chuan) 給下一代。敲低與(yu) 敲除二者zui明顯的區別是基因組DNA序列是否發生變化。