從《指導原則》中分析參考品盤設計

2019年12月05日國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心發布一版《腫瘤相關(guan) 突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價(jia) 通用注冊(ce) 技術審查指導原則(2019年第83號)》  （以下簡稱“指導原則”），該指導原則是針對腫瘤相關(guan) 基因檢測試劑分析性能評價(jia) 的一般要求，性能評價(jia) 主要思路是：提出產(chan) 品性能有效性、安全性相關(guan) 問題的假設，然後通過研究進行確認。

參考品作為(wei) 性能評價(jia) 的主要原材料，可謂是非常重要，文中對此做了詳細的要求，今天我們(men) 就參考品做一些討論。

原文：
4. 參考品要求
內(nei) 部參考品是保證產(chan) 品性能穩定性以及檢測值可溯源的重要構成之一。參考品研究應包括原料選擇、製備過程、定值研究及評價(jia) 指標等。申請人應對內(nei) 部陽性/陰性參考品的來源、基因序列設置等信息進行驗證，並提供參考品溯源過程的測量程序或參考方法的相關(guan) 信息及詳細的驗證資料。
具體(ti) 要求如下：
4.1陽性參考品及陽性質控品：
4.1.1陽性參考品
理想狀態下，陽性參考品應當包括對所申報產(chan) 品每個(ge) 基因型的質控樣本。但考慮到基於(yu) NGS技術的可檢測基因數量較多，申請人應結合產(chan) 品預期用途、臨(lin) 床意義(yi) 及基因類型等因素進行針對性和代表性的設計。
對於(yu) 有明確腫瘤伴隨診斷相關(guan) 的基因，應考慮該類基因參考品設置的合理性和完整性，需包括伴隨診斷相關(guan) 的全部熱點基因，建議采用臨(lin) 床樣本或細胞係提取的核酸儲(chu) 備液作為(wei) 原料。
對於(yu) 具有顯著臨(lin) 床意義(yi) 或潛在臨(lin) 床意義(yi) 的基因，應考慮代表性問題，明確具有臨(lin) 床診斷意義(yi) 的基因類型及基因型中不同的變異類型。突變頻率、變異類型的選取應具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。
如檢測編碼區較大且存在非熱點區域設計（如大於(yu) 1M），建議在陽性參考品中考慮對檢測整體(ti) 區域的靈敏度驗證（主要關(guan) 注SNV等），如混合的永生化正常人白細胞DNA儲(chu) 存液等。
不同突變/變異的變異豐(feng) 度及突變頻率，濃度範圍設置應具有代表性並提供這樣設定的依據。陽性參考品的突變形式及拷貝數需采用有效方法進行確認，並明確接受標準。申請人在設計陽性參考品時可一並考慮檢測限參考品的設置及確認方式，並提供相關(guan) 的依據。
4.1.2陽性質控品
模擬病人樣本的目標核酸序列，並用於(yu) 質控整個(ge) 檢測過程，包括核酸提取（如適用）、文庫構建、測序和數據分析。目前陽性質控檢測和分析過程應與(yu) 臨(lin) 床樣本方式一致。
4.2陰性參考品及陰性質控品
陰性參考品及陰性質控品建議為(wei) 正常臨(lin) 床樣本的混合物或細胞係，應明確不含有目標區域腫瘤突變基因。
4.3精密度參考品
精密度參考品設置要求可參考陽性/陰性參考品。
4.4 PCR 試劑無模板質控品（No Template Control，NTC）（如適用）
申請人應根據申報產(chan) 品特點設置NTC質控品及檢測接受標準，監測檢測過程中是否存在汙染。

從(cong) 原文中可以看出：
1.參考品是必須要的；
2.陽性參考品設置zui為(wei) 複雜，著重聚焦臨(lin) 床意義(yi) 的基因位點，不要求全覆蓋，同時要考慮靈敏度（zui低檢出限LoD）設置，考慮到濃度梯度或突變梯度的不同，應對各水平陽性參考品設置相應檢出要求；
3.陽性質控品應該匹配整個(ge) 檢測過程，檢測和分析應該與(yu) 臨(lin) 床樣本一致，用於(yu) 陽性、陰性的判斷；
4.陰性參考品和陰性質控品可以為(wei) 正常臨(lin) 床樣本或者細胞係，可以兩(liang) 者用同一個(ge) ；
5.精密度參考品主要用於(yu) 使用相同的樣本（包括檢測臨(lin) 界值附近的樣本）在各種特定條件下進行檢測（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測天數，不同儀(yi) 器等），並考慮檢測中主要的變異來源，通過重複性檢測來評價(jia) 性能；
6.NTC主要是用於(yu) 分析特異性，評估產(chan) 品僅(jin) 可檢測到預期待測變異的能力。

綜上所述，對於(yu) 參考品的設計，我們(men) 可以得出如下的表格（本設計僅(jin) 代表小編個(ge) 人意見）

按照這個(ge) 思路，我們(men) 一步一步來設計一個(ge) 完整的panel。
首先di一步是選擇基因位點，可以按照如下原則來設計：
1.如果是一個(ge) 小panel，一般設計都是針對某一癌種，對應的基因都是比較明確，位點能明確的盡量明確，不能明確的盡量涉及多種類型，比如SNV、Insertion、Deletion、Fusion、CNV，更細分的話，還有frameshift_variant、inframe_deletion、inframe_insertion、missense_variant、Splice_acceptor_Variant、Splice_Donor_Variant、Synonmymous_Variant等等。
因此對應的參考品要求覆蓋全基因，位點也盡量全覆蓋，參考品信息可以在科佰生物查詢，如果沒有的位點，可以聯係科佰生物定製位點。

2.如果是一個(ge) 大panel，對於(yu) 參考品、檢測限、精密度，一般是不可能做到所有基因全覆蓋，並且固定的%AF和CN值的，因此按照《指導原則》的要求，我們(men) 應該選擇具有臨(lin) 床意義(yi) 的基因和位點來表征，*的就是NCCN指南提及的基因，另外再加一些臨(lin) 床藥物研發的靶點和biomarker。其中需要特別注意的是由於(yu) NGS的探針原理，不能很好的分析出每一種fusion的斷點信息（DNA層麵，內(nei) 含子斷點不wei一），因此建議大Panel選擇RNA作為(wei) fusion的檢測對象，同樣的也需要選擇RNA作為(wei) 參考品。

對於(yu) 大panel的陽性質控品選擇，可以選擇泛腫瘤的質控品：

如下列舉(ju) 了常見的重要的基因位點信息，供大家參考，panel的參考品盤可以從(cong) 中選取：

（部分截圖）

有了選取的基因和位點，我們(men) 開始依次設計參考品、質控品、檢測限和精密度，

1.陽性參考品盤

1.1根據目的選擇全盤的基因和位點，比如按照癌種設計；
1.2盡量覆蓋所有的基因和位點；
1.3盡量覆蓋SNV、indel、fusion和CNV；
1.4盡量多種突變細分類型，尤其可以考慮一些內(nei) 含子的剪切變異；
1.5Fusion可以選擇DNA和RNA；
1.6多個(ge) 位點要拆包設計，不能把臨(lin) 近甚至相同位點放在一個(ge) 包裏麵；
1.7設計的每個(ge) 包突變頻率或者CN值固定，這樣利於(yu) 直接轉變為(wei) 檢測限標準品；
1.8不同包之間，盡量互補；
1.9一定要關(guan) 注內(nei) 源突變的影響；
1.10如果能兼顧精密度、質控盤的設計是合適的，這樣能一個(ge) 包多種用途。

參考品盤設計好之後，就是實際落地去定製，這其中又涉及倍性、拷貝數的計算，還有終檢測的QC標準，一般是選擇DdPCR定標，這些工作可以交給科佰生物，我們(men) 可以按照客戶的要求定製符合標準的參考盤混合標準品。

2.檢測限參考品
檢測限參考品的設計比較簡單，隻要將前麵定製的參考品盤稀釋到待測的檢測限即可，至於(yu) 下降到什麽(me) 標準，依據平台、待測樣本等因素而定，一般靈敏度是早篩>液體(ti) 活檢>組織檢測。

3.精密度參考品
精密度參考品一般是用於(yu) 看體(ti) 係的重複性，因此取決(jue) 於(yu) 實驗室各項的變數多不多，對於(yu) 單批次的參考品需要在不同條件下測試，同時不同批次的參考品也需要在不同條件下測試，尤其是LoD附近的檢測重複性。
因此如果能做到*把參考品的全部包都能充分驗證精密度是佳的，但是這樣的話確實成本、周期都比較長，折中的選擇是盡量選擇全部的基因，位點可以是一部分，選擇一個(ge) 適中的突變頻率或者CN值，再選擇一個(ge) LoD附近的突變頻率或者CN值（當然一般建立體(ti) 係時還未知LoD的範圍，因此這個(ge) 可以後期測試），來做精密度的性能評價(jia) 。

4.陽性質控品盤
陽性質控品盤應該匹配整個(ge) 檢測過程，檢測和分析應該與(yu) 臨(lin) 床樣本一致，用於(yu) 陽性、陰性的判斷。
4.1可以選擇細胞沉澱、石蠟塊這樣的樣品形式，包含提取的過程；
4.2陽性質控品使用頻率高，可以批量製備；
4.3陽性質控品用於(yu) 陽性判斷，因此隻要包含所有的基因，不用所有的位點；
4.4陽性質控品用於(yu) 陽性判斷，出於(yu) 容易檢出的目的，可以設計高一些的突變頻率和CN值。

科佰生物推出一款現貨陽性質控品盤，包含基因多，突變種類齊全，可以點擊表格查看。

推薦陽性質控品盤：

針對大panel的陽性質控品，可以考慮泛腫瘤大panel參考品。

5.陰性參考品
陰性參考品建議為(wei) 正常組織或者細胞係，隻要明確不含有目標區域腫瘤突變基因即可。這裏需要提醒的有四點：
5.1陰性參考品用量比較大；
5.2陰性參考品選擇容易製備，而且穩定的樣品，穩定是指穩定供應、基因組穩定；
5.3陰性參考品的突變驗證盡量選擇深度高的NGS或者DdPCR；
5.4陰性參考品還要測對應基因的CN值和倍性；

推薦陰性參考品：

6.陰性質控品
參照5. 陰性參考品

現在分子診斷技術日新月異，傳(chuan) 統的PCR、Q-PCR、AMRS-PCR、FISH，一直都被大量用於(yu) 臨(lin) 床診斷，到現在如日中天的NGS，越來越得到大家的認可，再到下一代的三代測序，讀長長，周期短，便攜，未來預期美好。技術的革新給患者帶來新的希望，質量保障是希望的前提，參考品盤是質量檢測有力的工具。

我們(men) 呼籲業(ye) 內(nei) 的每一家單位的每一個(ge) 檢測，都能用上參考品，對我們(men) 每一份發出的數據都能負責。