【新品發布】DdPCR試劑盒開發與驗證

PCR技術從(cong) 1983年開始依次經曆普通PCR，Real-Time PCR和dPCR，現如今dPCR技術的發展就像1990年代末的Real-Time PCR發展一樣，發展迅猛。

下麵我們(men) 以DdPCR為(wei) 例，討論dPCR技術。

什麽(me) 是DdPCR? 有什麽(me) 技術特征？有哪些方麵的應用？

DdPCR全稱Droplet Digital PCR，引用bio-rad的描述為(wei) Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.

從(cong) 基本原理我們(men) 不難看出，DdPCR大的優(you) 點是定量，表現為(wei) ：

• 定量 -ddPCR技術無需輸入標準曲線即可提供每個輸入樣品的目標DNA拷貝的計數,使該技術非常適合目標DNA的測量，病毒載量分析和微生物定量；
• 的精確度 – ddPCR提供的大量樣品分配功能可以可靠地測量樣品中靶DNA序列拷貝數的微小差異；
• 提高信噪比 -稀釋高拷貝模板和背景，有效富集靶標陽性分區中的模板濃度，從而可以靈敏地檢測稀有靶標，並實現±10％的定量精度，靈敏度可達單個核酸分子，檢測限低至0.001%；
• 消除PCR偏差 -消除qPCR的擴增效率依賴性，降低了錯誤率，可檢測到小的（1.2倍）差異，這裏需要指出的是；
• 降低了耗材成本 -反應體積在皮升至納升的範圍內，減少了試劑的使用和每個數據點所需的樣品量，對於珍貴的樣品尤其適用；
• 降低設備成本 -基於乳液的反應係統意味著PCR反應可以在標準的熱循環儀中進行，而無需複雜的芯片或微流體。
• 出色的分區 -ddPCR技術每20 µl樣品可產生20,000個液滴，在96孔板上可進行近200萬個分區PCR反應，分區數量越多，精度越高。

DdPCR技術有很多方麵的應用，我們(men) 按照發表文章的領域，可以簡單劃分為(wei) ： 

結合腫瘤領域，我們(men) 一般與(yu) 之相關(guan) 的有4個(ge) 領域的應用：

• 檢測Gene Expression，主要是檢測mRNA的定量分析；
• 檢測Mutation（SNV和Indel），可以檢測拷貝數，也可以檢測比率；
• 檢測CNV（拷貝數變異分析），相對定量；
• 檢測Fusion，可以檢測拷貝數，也可以檢測比率；

同樣的，科佰生物也針對這4個(ge) 應用開發對應的檢測試劑盒，配套科佰生物的參考品，對試劑盒做性能評價(jia) ，如下我們(men) 以EGFR T790M為(wei) 例：

實驗一：靈敏度測試

待測樣本：不同%AF的EGFR T790M的標準品，依次為(wei) 5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%。

首先我們(men) 選擇50%的EGFR T790M標準品(CBP10402)，該標準品是通過基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為(wei) mutation，一條為(wei) WT，經過理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗證，確認為(wei) 50%的頻率。然後使用對應的host cell的gDNA，按照質量比（Qubit 3.0 三次定量取平均）有限稀釋到5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%，每個(ge) 樣本準備3個(ge) 重複，合計18個(ge) 樣本同一次實驗檢測對應的頻率。

對應的數據為(wei) ：

由以上數據可見，EGFR T790M檢測體(ti) 係，對於(yu) 0.1%都是能檢出，且符合標準，但是波動比較大。另外實驗過程中，我們(men) 發現雖然DdPCR理論上可以生成20000個(ge) 液滴，但是多次實驗表明，實際生成往往是低於(yu) 這個(ge) 數值，平均約為(wei) 8000-10000個(ge) ，液滴數越少，因此低於(yu) 0.1%的頻率可能會(hui) 波動很大，影響真實值判斷。

實驗二：重複性測試

待測樣本：取1%和0.1%的EGFR T790M的標準品，分成8份，每份上樣10ng，一次實驗完成對應的定標。

對應的數據為(wei) ：

由以上數據可見，EGFR T790M檢測體(ti) 係是穩定可重複的，全部能檢出。

同樣的我們(men) 也對Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion開發了部分DdPCR試劑盒，利用科佰*的標準品產(chan) 品，我們(men) 做了性能評價(jia) ，陸續上線了多款產(chan) 品，如下是我們(men) 已經上線的DdPCR探針、引物的清單，全部在QX200上驗證過：

更多的DdPCR產(chan) 品可以選擇科佰生物開發定製，我們(men) 不僅(jin) 可以開發定製探針、引物，我們(men) 還有標準品用於(yu) 驗證體(ti) 係性能評價(jia) 。