新型冠狀病毒：用於診斷的假病毒標準品和用於藥物研發的假病毒模型

截止今天，2019-nCoV已經在多國出現，在中國人教科書(shu) 式的疫情戰役之後，突然在韓國、日本、意大利、伊朗、新加坡等國家出現明顯的確診病例增長，顯然這已經是所有人應該重視應對的問題了。

我們(men) 知道2019-nCoV具有很強的傳(chuan) 染性，隔離措施是非常必要的，針對疑似病例診斷的可靠性就是重中之重了。在前段時間，我們(men) 發現臨(lin) 床的核酸診斷出現很大概率的假陰性，繼而確診時我們(men) 就結合了臨(lin) 床指標，確保每個(ge) 病人能及時準確的得到治療。

那我們(men) 不禁會(hui) 問：核酸檢測作為(wei) 金標準，為(wei) 什麽(me) 會(hui) 出現這麽(me) 大的假陰性概率？原因是多方麵的，比如取樣部位的差異，潛伏期病毒滴度低，Q-PCR的相對定量判斷原則，試劑盒的檢測限等等。

科佰生物作為(wei) 一家提供診斷標準品和藥物研發模型的公司，今天就這診斷和藥物研發兩(liang) 方麵我們(men) 做下討論。

我們(men) 可以分析下2019-nCoV的結構，與(yu) 其他beta類冠狀病毒一致，一類具有囊膜、基因組為(wei) 線性單股正鏈的RNA病毒，其中關(guan) 鍵的基因有ORF1ab、Gene S、Gene E、Gene M和Gene N。

1. ORF1ab包含RdRP（RNA-dependent RNA polymerase），RNA聚合酶用於(yu) RNA的合成，常被用於(yu) 診斷；

2. S蛋白，穿過病毒膜，並在冠狀病毒“冠狀”中形成特征性的尖峰，它被高度糖基化，可能形成同源三聚體(ti) ，並介導受體(ti) 結合和與(yu) 宿主細胞膜融合，刺激中和抗體(ti) 的主要抗原以及細胞毒性淋巴細胞的重要靶標在S蛋白上，被用於(yu) 藥物研發。

3. 小包膜E（envelope protein）蛋白將其C末端留在包膜內(nei) ，然後跨越該包膜或彎曲並在內(nei) 部投射其N末端。

4. M蛋白（membrane glycoprotein）具有一個(ge) 短的N末端結構域，該結構域在包膜的外表麵上突出並跨過該包膜3次，在包膜內(nei) 留有一個(ge) 長的C末端，M蛋白在病毒裝配中起重要作用。

5. 核衣殼蛋白N（nucleocapsid phosphoprotein）與(yu) RNA基因組結合形成核衣殼。它可能參與(yu) 病毒RNA合成的調控，並可能在病毒出芽過程中與(yu) M蛋白相互作用。

用於(yu) 診斷的假病毒標準品

根據WHO公布，的診斷主要是圍繞N基因，另外附加其他的基因作為(wei) 確認，對應的protocol，請點擊查看。

N基因，全長1260bp，以美國CDC為(wei) 例，直接在N基因中選擇了3對引物、探針，而且對N1、N2、N3都做了特異性比對分析和特異性檢測分析，結論是N1和N2都是非常特異的，N3能同時檢測SARS和bat SARS。

同樣的CDC也做了檢測限分析，數據可以說是非常漂亮，展示了非常強的靈敏度：

但是我們(men) 發現整個(ge) 性能評價(jia) ，都是使用體(ti) 外轉錄的N gene RNA，然後用人A549細胞和viral transport medium (VTM)來稀釋，作為(wei) 模擬病毒標準品做的。這樣我們(men) 不經會(hui) 問，是否有更合適的標準品用於(yu) 性能評價(jia) ？

按照2020年02月12號國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心發布的指導原則《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊(ce) 技術審評要點》中明確指出：陽性質控品可用1～2個(ge) 病毒株為(wei) 代表，應含有天然的或人工合成的包含試劑盒可檢測靶序列（如假病毒），陰性參考品則主要涉及對交叉反應的驗證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。

科佰生物應對核酸診斷的需求，開發了一係列的假病毒標準品（假病毒也是病毒，有核酸RNA和外殼蛋白組成，但是無致病性，隻需P2級），幫助企業(ye) 做試劑盒的性能評價(jia) ，具體(ti) 產(chan) 品線為(wei) ：

以2019-nCoV Gene N為(wei) 例，假病毒包含全長1260bp，滿足不同客戶對不同序列的需求，假病毒含有Gene N的1260bp的RNA，同時也有完整的包膜結構，需要用試劑盒提取，反轉錄，開展下遊的dPCR檢測。我們(men) 采用了Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit提取，使用蘇州銳訊開發的《新型冠狀病毒（COVID-19）核酸檢測試劑盒》一步法反轉錄，然後再PCR擴增儀(yi) （SG-200）上對病毒的拷貝數定量。

得到2019-nCov-N Pseudovirus Standard Reference的拷貝數為(wei) 5.03*10e8/ml。

用於(yu) 藥物研發假病毒模型

2月16日，美國德克薩斯大學*分校和美國國家衛生研究院科研人員聯合在預印本平台bioRxiv上發布了對2019新型冠狀病毒的研究發現：他們(men) 確定了處於(yu) 預融合構象的2019新型冠狀病毒刺突蛋白（S蛋白）的冷凍電鏡結構，同時發現，人體(ti) ACE2蛋白與(yu) 新型冠狀病毒S蛋白結合的親(qin) 和力，比與(yu) SARS病毒S蛋白結合的親(qin) 和力高10到20倍。

S蛋白通過其受體(ti) 結合區識別ACE2，因此，研究人員就以受體(ti) 結合區為(wei) 靶標製備抗體(ti) ，目的是阻斷受體(ti) 結合區與(yu) ACE2的相互作用。美國研究團隊還檢測了幾株SARS病毒受體(ti) 結合區（receptor-binding domain，RBD）特異性單克隆抗體(ti) ，發現它們(men) 與(yu) 新型冠狀病毒S蛋白的受體(ti) 結合區沒有明顯結合，這提示這兩(liang) 種病毒受體(ti) 結合區之間的抗體(ti) 交叉反應可能是有限的。

因此針對2019-nCoV的S蛋白藥物開發，尤其是大分子藥物開發，可能沒有什麽(me) 捷徑可走，需要一步一步建立模型體(ti) 係，篩選出有活性的藥物。

針對S蛋白和ACE2的結合阻斷，我們(men) 可以開發生化水平的檢測，比如兩(liang) 種蛋白的結合阻斷ELISA，那是否有細胞水平的模型？真實的模擬病毒侵染細胞的過程，進而阻斷，來反應藥物的效果呢？答案是有的。

科佰生物開發了一種表達S蛋白的假病毒，該假病毒依靠S蛋白侵染目的細胞，與(yu) 目的細胞結合，進而殺死目的細胞，檢測到信號，大限度的模擬病毒的感染過程。同時該假病毒沒有致病性，隻需要P2級實驗室即可，是用於(yu) 藥物研發合適的細胞水平的評估模型。

對應的產(chan) 品線

2019-nCoV新型冠狀病毒已然是人的公敵，看著前線醫務人員的付出，希望我們(men) 生物人，也能貢獻自己的力量。