【連載-企業參考品】肺癌PCR和NGS參考品的選擇

科佰生物作為(wei) 一家提供企業(ye) 核酸診斷標準品的企業(ye) ，在該領域已經深耕多年，與(yu) 全國該領域90%的企業(ye) 都有過合作，成功支持過很多企業(ye) 的試劑盒研發和獲批，在該領域有豐(feng) 富的經驗。根據我們(men) 對市場的調研，對客戶需求的理解，我們(men) 把我們(men) 的產(chan) 品線劃分為(wei) 多個(ge) 模塊，主要為(wei) 支持PCR的單點mutation、fusion和CNV產(chan) 品，支持NGS的小panel和大panel(泛腫瘤、包含TMB和MSI)產(chan) 品，支持IHC和Fish的FFPE block產(chan) 品，支持標準品定標的dPCR檢測試劑盒產(chan) 品等。

接下來的幾期，我們(men) 陸續會(hui) 針對不用的腫瘤，遵循NCCN指南的標注，為(wei) 大家分享我們(men) 對企業(ye) 參考品選擇的看法。

肺癌（Lung cancer）是惡性的肺部腫瘤，肇因於(yu) 肺部組織細胞不受控製地生長。如不治療，腫瘤細胞會(hui) 轉移至鄰近組織或身體(ti) 的其他地方。肺部常見的原發性惡性腫瘤屬於(yu) 上皮癌，可粗分為(wei) 小細胞癌（SCLC）和非小細胞癌（NSCLC）。根據《2018年癌症統計數據》顯示：

1. 2018年將有大約1810萬(wan) 癌症新發病例和960萬(wan) 癌症死亡病例。

2. 肺癌依舊是發病率（11.6%）和死亡率（18.4%）較高的惡性腫瘤。發病率其次為(wei) 女性乳腺癌（11.6%）、前列腺癌（7.1%）、結直腸癌（6.1%）；死亡比例其次為(wei) 結直腸癌（9.2%）、胃癌（8.2%）、肝癌（8.2%）。 

從(cong) 中國來看，肺癌是發病率（女性為(wei) 乳腺癌較高）和死亡率較高的癌癌種。

肺癌的治療一般分為(wei) 外科治療、放療、化療和免疫治療，針對化療和免疫治療，臨(lin) 床已經有很多靶向藥物，包含小分子和大分子藥物，出於(yu) 精準診療的原則，治療前分子與(yu) 生物標誌物的分析尤為(wei) 重要，針對肺癌的分子標誌物主要包含EGFR，ALK，ROS1,BRAF,KRAS,MET,RET,ERBB2,PD1/PDL1,TMB(TMB是一個(ge) 可能有助於(yu) 選擇適於(yu) 免疫治療患者的新型生物標誌物，目前尚無測量TMB的共識)，各個(ge) 分子標誌物的臨(lin) 床意義(yi) 和指導，請點擊下載NCCN指南。因此圍繞這些基因的診斷對肺癌的治療有著非常重要的作用，被廣泛應用於(yu) 臨(lin) 床。

自然而然，國內(nei) 外針對肺癌開發的診斷試劑盒是熱門的，也是比較成熟的，甚至可以說作為(wei) 腫瘤領域診斷公司的一張入場券，不管是已經獲批的，還是正在申報的，甚至剛開始研發的，大家都在這個(ge) 領域摩拳擦掌，準備大幹一番。

圍繞肺癌診療相關(guan) 的EGFR,ALK，ROS1,BRAF,KRAS,MET,RET,ERBB2,PD1/PDL1,TMB(TMB是一個(ge) 可能有助於(yu) 選擇適於(yu) 免疫治療患者的新型生物標誌物，目前尚無測量TMB的共識)，我們(men) 依次分析各個(ge) 基因在診療中的選擇。

分子標誌物：EGFR

➢表皮生長因子受體(ti) (EGFR)基因突變: EGFR 是一種常見於(yu) 上皮細胞表麵的受體(ti) 酪氨酸激酶，在多種人類惡性腫瘤中往往呈過表達。

EGFR中常見的突變(外顯子19缺失,外顯子21中p.L858R點突變)與(yu) EGFR酪氨酸激酶抑製劑(TKI)治療的應答情況相關(guan) ;近期的資料表明未攜帶EGFR敏感突變的腫瘤不應在任何時段的治療中接受EGFR TKI的治療。

²一些少見的EGFR突變,這類突變累計占到EGFR突變非小細胞肺癌的近10% (例如，外顯子19插入，p.L861Q、 p.G719X、p.S768I) 也與(yu) EGFR酪氨酸激酶抑製劑(TKI) 治療的應答情況相關(guan) ，但所研究的患者數目較少。

²一些EGFR突變與(yu) EGFR酪氨酸激酶抑製劑(TKI) 治療的應答情況缺乏相關(guan) 性，包括大多數EGFR外顯子20插入，以及p.T790M。

-大多數EGFR外顯子20插入突變預示著對臨(lin) 床可達到的酪氨酸激酶抑製劑治療(TKI) 水平的抵抗(耐藥)。

-例外情況是一種罕見的EGFR外顯子20插入變異型，p.A763_ Y764insFQEA,其與(yu) EGFR酪氨酸激酶抑製劑(TKI) 治療的應答情況相關(guan) 。因此,對EGFR外顯子20插入的認識必須建立在特定基因序列變異的基礎上。

-與(yu) EGFR TKI初始治療後疾病複發常見的相關(guan) 發現是p.T790M突變,這是已知的耐藥機製。如果在TKI暴露前發現該突變,則應考慮行遺傳(chuan) 谘詢，因為(wei) 種係p.T790M突變與(yu) 家族性肺癌易感性有關(guan) ，故需要額外的檢測。

²隨著高通量測序(NGS)檢測使用的增加，其它EGFR變異型的檢出率也在增高;但是，個(ge) 體(ti) 變異的臨(lin) 床意義(yi) 不易明確。

²某些臨(lin) 床病理特征——諸如吸煙情況、 種族和組織學特征——均與(yu) 某種EGFR突變的存在情況相關(guan) ;不過，這些特征不應用於(yu) 選擇接受檢測的患者。

²檢測方法:實時聚合酶鏈反應(PCR)、 桑格(Sanger)測序法(配合腫瘤富集操作)，以及高通量測序法(NGS) 是檢測EGFR突變狀態的常用的方法。

分子標誌物：ALK

➢簡變性淋巴瘤激酶(ALK) 基因重排: ALK 是非小細胞肺癌中一種可被重排的受體(ti) 酪氨酸激酶，重排導致通過ALK激酶結構域的信號轉導失調和異常。

²ALK常見的融合對象是棘皮動物微管相關(guan) 樣蛋白4 (EML4),但其它多種融合對象也已經被發現。

²ALK重排的存在與(yu) 對ALK酪氨酸激酶抑製劑治療(TKI)的應答情況相關(guan) ,近期研究顯示在一線治療中阿來替尼(Alectinib) 比克唑替尼(Crizotinib) 的療效更佳。

²某些臨(lin) 床病理特征——諸如吸煙情況和組織學特征已被證實與(yu) 某種ALK重排的存在情況相關(guan) ;不過，這些特征不應用於(yu) 選擇接受檢測的患者。

²檢測方法:熒光原位雜交(FISH)分離探針法是一個(ge) 廣泛使用的方法。免疫組化法可作為(wei) 一種有效的篩查手段使用。經FDA批準的免疫組化法(ALK[D5F3]CDx檢測)可單獨使用，無需經FISH確認結果，但鼓勵對結果行二次確認。多種高通量測序(NGS)法可檢測ALK融合突變,而有時會(hui) 用到靶向實時多聚酶鏈反應(PCR)檢測,不過它們(men) 均不太可能檢出帶有新的融合對象的突變。

分子標誌物：ROS1

➢ROS1 (ROS原癌基因1)基因重排: ROS1是非小細胞肺癌中一種可被重排的受體(ti) 酪氨酸激酶,重排導致通過ROS1激酶結構域的信號轉導失調和異常。

²發現的ROS1融合對象有多種，常見的融合對象包括: CD74、 SLC34A2、 CCDC6 和FIG。

²ROS1重排的存在與(yu) 口服ROS1酪氨酸激酶抑製劑(TKI)療效相關(guan) 。

²某些臨(lin) 床病理特征——諸如吸煙情況和組織學特征——已被證實與(yu) 某種ROS1 重排的存在情況相關(guan) :不過，這些特征不應用於(yu) 選擇接受檢測的患者。

²檢測方法:熒光原位雜交(FISH)分離探針法可以使用:不過,其可能無法檢測FIG-ROS1變異型。免疫組化法(IHC)可以使用;不過,針對ROS1融合突變的IHC檢測敏感性低，而隨訪驗證性檢驗是作為(wei) 一種篩查手段使用的ROS1 IHC法*的一部分。多種高通量測序(NGS)法可檢測ROS1融合突變,而有時會(hui) 用到靶向實時多聚酶鏈反應(PCR) 檢測，不過它們(men) 均不太可能檢出帶有新的融合對象的突變(這樣會(hui) 導致無法檢出ROS1融合事件)。

分子標誌物：BRAF

➢BRAF (B-Raf原癌基因)點突變：BRAF是一種絲(si) 氨酸/蘇氨酸激酶,屬於(yu) 經典的MAP/ERK信號通路的一部分。BRAF突變激活導致通過MAP/ERK路徑信號轉導失調。

²BRAF突變可見於(yu) 非小細胞肺癌。導致氨基酸位點600發生變化(p.V600E)的某種特定突變的存在已被證實與(yu) 口服型BRAF和MEK抑製劑聯合治療的效果(應答情況)相關(guan) 。

²注意其它BRAF突變已在非小細胞肺癌中被觀察到，而目前這些突變對於(yu) 治療選擇的影響尚未明確。

²檢測方法:實時聚合酶鏈反應(PCR)、桑格(Sanger) 測序法(配合腫瘤富集操作)，以及高通測序法(NGS)是檢測BRAF突變狀態的常用的方法。盡管一種抗-BRAF p.V600E-特異性單克隆抗體(ti) 已投入商用，而且一些研究已經測評了該方法的應用情況，但隻有在大規模驗證後才應該使用該方法。

分子標誌物：KRAS

➢KRAS (KRAS原癌基因)點突變: KRAS是一種具有內(nei) 在GTP酶活性的G蛋白，而激活突變導致通過MAP/ERK路徑信號轉導失調。

²KRAS突變常見於(yu) 密碼子12,但其它突變類型也可在非小細胞肺癌中見到。

²當與(yu) 無KRAS突變的腫瘤患者相比，KRAS突變的存在預示生存不良。

²KRAS 突變已被證實與(yu) EGFR TKI治療的效果(應答情況)降低相關(guan) 。

²由於(yu) 變異靶點的重疊可能性小，故KRAS突變的存在可能表明患者將不會(hui) 從(cong) 進一步的分子檢測中獲益。

分子標誌物：其他

·靶向治療中疾病進展時的檢測:

➢受惠於(yu) 上文列舉(ju) 的多個(ge) 檢測項，對治療耐藥的分子機製的認識也隨之增加。當靶向治療中疾病活動性進展時，對標本重新檢測可為(wei) 下一步治療提供線索:

²對於(yu) 已經EGFR TKI治療，攜帶有潛在的EGFR敏感突變的患者，適宜的檢測項目起碼包括p.790M的高敏評估:當沒有p.T790M存在證據時，針對替代性耐藥機製(MET擴增、ERBB2擴增)的檢測可被用來指導患者的其它治療。p.T790M 的存在可指示患者接受第三代EGFR TKI治療。

-檢測EGFR p.T790M的試驗設計的分析敏度應至少達到5%等位基因分數。早期的敏感突變可被用作許多試驗中的一種內(nei) 部對照以確定如果作為(wei) 亞(ya) 克隆事件存在的話，p.T790M 是否處於(yu) 檢測範圍內(nei) 。

²對於(yu) 已經ALK TKI治療的攜帶有潛在ALK重排突變的患者,還不清楚發現特定的酪氨酸激酶結構域突變是否能確定合理的下一步治療,但一些初步數據提示特定的酪氨酸激酶結構域突變能影響後續治療。

其中涉及的基因有MET skiping、MET擴增、RET重排和ERBB2擴增。

分子標誌物：panel

對於(yu) PCR的企業(ye) 參考品，如上的位點基本全部滿足了，那針對NGS的panel型參考品，我們(men) 需要把重要的位點一起檢測，這就要要求混樣，混樣有一定的原則，根據混樣的原則和市場需求，我們(men) 開發了一些參考盤，具體(ti) 如下：

綜上，按照NCCN的指南，按照臨(lin) 床的藥物，按照伴隨診斷的需求，科佰生物開發了針對肺癌PCR的單點參考品、標準品，針對肺癌NGS的panel型的參考品、標準品，滿足不同客戶的需求。

標準品選擇好了，接下來就是做性能評價(jia) ，讓我們(men) 先學習(xi) 下指導原則，對於(yu) 性能評價(jia) 的規定。詳見。