CD74-ROS1的藥靶模型+DNARNA標準品+ddPCR試劑盒

ROS原癌基因 1 (ROS1) 由位於(yu) 染色體(ti) 6q22.1的ROS1基因編碼，屬於(yu) 酪氨酸激酶胰島素受體(ti) 亞(ya) 家族，於(yu) 1986年在涉及肌肉瘤RNA UR2腫瘤病毒的研究中被發現。ROS1的生理作用仍存在爭(zheng) 議；其表達主要在肺組織中觀察到，其次是宮頸和結腸。可以想象，酪氨酸激酶胰島素受體(ti) 在胚胎發育中起著關(guan) 鍵作用。ROS1蛋白顯示出與(yu) ALK（均屬於(yu) 胰島素受體(ti) 超家族）的大量同源性，特別是在ATP結合位點（84% 同源性）和激酶域（64% 同源性）。ROS1的融合突變，通常會(hui) 導致與(yu) 幾個(ge) 融合夥(huo) 伴的基因融合，由此產(chan) 生的融合蛋白是強大的致癌驅動因素。因此，ROS1激酶活性被持續激活，由於(yu) JAK/STAT、PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的上調，導致細胞增殖、存活和遷移增加。ROS1已在體(ti) 外和體(ti) 內(nei) 顯示出致瘤潛力，膠質母細胞瘤是第一個(ge) 顯示出具有 ROS1重排的人類癌症。隨後在其他惡性腫瘤中觀察到ROS1融合，包括 NSCLC、黑色素瘤和偶爾的膽管癌、血管肉瘤、卵巢癌、胃癌和結直腸癌。ROS1改變既不能遺傳(chuan) 也不能作為(wei) 基因改變獲得。

ROS1的重排約占NSCLC患者的2%，在NSCLC中常見的融合夥(huo) 伴如下表所示，其中占比最高的是CD74基因。

Table 1. Main ROS1 fusion partners in non-small cell lung cancer (NSCLC).

CD74位於(yu) 染色體(ti) 5q33.1，該基因編碼的蛋白質與(yu) II類主要組織相容性複合體(ti) (MHC) 相關(guan) ，是調節免疫反應抗原呈遞的重要分子伴侶(lv) 。它還充當細胞因子巨噬細胞遷移抑製因子 (MIF) 的細胞表麵受體(ti) ，當其與(yu) 編碼的蛋白質結合時，會(hui) 啟動存活途徑和細胞增殖。這種蛋白質還與(yu) 澱粉樣前體(ti) 蛋白 (APP) 相互作用並抑製澱粉樣蛋白 β (Abeta) 的產(chan) 生。

在非小細胞肺癌的診斷中，NCCN指南明確描述“ROS1 is a receptor tyrosine kinase that can be rearranged in NSCLC, resulting in dysregulation and inappropriate signaling through the ROS1 kinase domain."強調了ROS1的分子診斷的意義(yi) ，是必須要檢測的一個(ge) 分子marker，同時推薦的檢測方法描述為(wei) “FISH break-apart probe methodology can be deployed; however, it may under-detect the FIG-ROS1 variant. IHC approaches can be deployed; however, IHC for ROS1 fusions has low specificity, and follow-up confirmatory testing is a necessary component of utilizing ROS1 IHC as a screening modality. Numerous NGS methodologies can detect ROS1 fusions, although DNA-based NGS may under-detect ROS1 fusions. Targeted real-time PCR assays are utilized in some settings, although they are unlikely to detect fusions with novel partners."

全套合集之一：藥靶模型

CD74-ROS1融合蛋白，可以組成型激活細胞增殖，選擇在依賴IL3的BaF3細胞模型上，外源過表達CD74-ROS1蛋白，可以作為(wei) 驅動基因，驅動Baf3細胞的增殖，而不需要IL3，因此可以用於(yu) 針對CD74-ROS1的抑製劑的活性檢測。基於(yu) 以上的原理，科佰生物開發了CD74-ROS1/Baf3藥靶模型，可以在In vitro層麵檢測樣本的抑製活性，同樣也可以在in vivo層麵做CDX模型，檢測藥物的活性。

Fig 1. Sanger sequencing of CD74-ROS1/BaF3(CBP73331)，左側(ce) 為(wei) CD74基因，右側(ce) 為(wei) ROS1基因。

Fig 2. Cell-based kinase assay of CD74-ROS1/BaF3(CBP73331)，不同陽性藥物對CD47-ROS1細胞增殖抑製的活性比較。

全套合集之二：DNA標準品

我們(men) 知道CD74位於(yu) 5號染色體(ti) 上，ROS1位於(yu) 6號染色體(ti) 上，CD74-ROS1融合是一種易位融合，常見的CD74(E6)-ROS1(E34)在臨(lin) 床病人的DNA測序上，CD74的斷點是在6號內(nei) 含子上，ROS1的斷點是在33號內(nei) 含子上，而且不同的病例，斷點不止一個(ge) ，因此基於(yu) CD74-ROS1在DNA層麵的標準品，首先肯定斷點在內(nei) 含子上，其次一種標準品僅(jin) 代表一種斷點。基於(yu) 以上信息，科佰生物通過基因編輯技術開發定製了一款DNA層麵的CD74(E6)-ROS1(E34)，通過sanger測序、ddPCR檢測對DNA做定標，發布一款DNA標準品。

Fig 3. Sanger sequencing of CD74-ROS1 Translocation(CBP20177D)，左側(ce) 為(wei) CD74基因，右側(ce) 為(wei) ROS1基因，斷點為(wei) 內(nei) 含子斷點。

Fig 4.ddPCR of CD74-ROS1 Translocation(CBP20177D)，檢測顯示該標準品突變頻率為(wei) 50%。

全套合集之三：RNA標準品

CD74-ROS1融合在病理上有意義(yi) ，主要是因為(wei) 融合蛋白的活性，也就是說，假設DNA層麵出現融合，但是沒有RNA，進而沒有蛋白，其實也沒有任何意義(yi) 的，因此針對CD74-ROS1的RNA的檢測，會(hui) 更有意義(yi) 。科佰生物通過基因重組的技術，在RNA層麵定製出CD74(E6)-ROS1(E34)的細胞模型，再通過sanger測序，ddPCR檢測對RNA做定標，發布一款RNA標準品。

Fig 5. Sanger sequencing of CD74-ROS1 Fusion(CBP20170R)，左側(ce) 為(wei) CD74基因，右側(ce) 為(wei) ROS1基因，斷點為(wei) 外顯子斷點。

Fig 6. DdPCR of CD74-ROS1 Fusion(CBP20170R)，檢測顯示該標準品拷貝數為(wei) 2244.5copies/ng。

全套合集之四：ddPCR試劑盒

不管是針對CD74-ROS1融合的藥物研發，還是診斷，在各種應用檢測中，都少不了PCR的檢測技術，比如在藥靶模型的構建中，我們(men) 可以使用PCR的技術看外源基因是否過表達，看陽性比例，篩選克隆，方法學優(you) 化等等，比如在診斷中，可以篩選陽性病人，性能評價(jia) ，平時的質控等等。在PCR技術中，ddPCR是一種靈敏度高的絕對定量的一種方法，比起Q-PCR，靈敏度高，不需要做標準曲線，比起NGS，成本低，周期短，能快遞出結果。科佰生物開發了針對DNA和RNA的ddPCR檢測試劑盒，適用於(yu) 在藥物研發和臨(lin) 床診斷中的檢測。

Fig 7. 針對CD74-ROS1的DNA層麵ddPCR性能評價(jia) ，使用標準品稀釋到不同的%AF，在不同的%AF下顯示準確的檢測能力。

Fig 8. 針對CD74-ROS1的RNA層麵ddPCR性能評價(jia) ，使用標準品稀釋到不同的拷貝數，在不同的拷貝數下顯示準確的檢測能力（注意RNA需要反轉錄為(wei) cDNA檢測，反轉錄需要在*相同的體(ti) 係下開展）。