細胞培養Q&A

1. 冷凍管應如何解凍？

取出冷凍管後， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鍾內(nei) 全部融化， 並注意水麵不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生汙染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。

 
2 細胞冷凍管解凍培養(yang) 時， 是否應馬上去除DMSO？
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分星空体育官方网站首页（包括懸浮性細胞）， 在解凍之後， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yang) 基之培養(yang) 角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yang) 基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍後細胞無法生長或貼附之問題。
 
3 可否使用與(yu) 原先培養(yang) 條件不同之培養(yang) 基？
不能。每一星空体育官方网站首页均有其特定使用且已適應之細胞培養(yang) 基， 若驟然使用和原先提供之培養(yang) 條件不同之培養(yang) 基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。
 
4 可否使用與(yu) 原先培養(yang) 條件不同之血清種類？
不能。血清是細胞培養(yang) 上一個(ge) 極為(wei) 重要的營養(yang) 來源， 所以血清的種類和品質對於(yu) 細胞的生長會(hui) 產(chan) 生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內(nei) 容物上都有所不同，血清使用錯誤常會(hui) 造成細胞無法存活。
 
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩(liang) 者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
 
6 培養(yang) 細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養(yang) 基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為(wei) pH 的緩衝(chong) 係統， 而培養(yang) 基中NaHCO3 的含量將決(jue) 定細胞培養(yang) 時應使用的CO2 濃度。當培養(yang) 基中NaHCO3 含量為(wei) 每公升3.7 g 時，細胞培養(yang) 時應使用10 % CO2；當培養(yang) 基中NaHCO3 為(wei) 每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養(yang) 細胞。
 
7 何時須更換培養(yang) 基？
視細胞生長密度而定， 或遵照星空体育官方网站首页基本數據上之更換時間，按時更換培養(yang) 基即可。
 
8 培養(yang) 基中是否須添加抗生素？ 除於(yu) 特殊篩選係統中外， 一般正常培養(yang) 狀態下， 培養(yang) 基中不應添加任何抗生素。
 
9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為(wei) 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶後應立即少量分裝於(yu) 無菌試管中， 保存於(yu) –20 °C，避免反複冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 並可減少汙染之機會(hui) 。

10 懸浮性細胞應如何繼代處理？
一般僅(jin) 需持續加入新鮮培養(yang) 基於(yu) 原培養(yang) 角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養(yang) 液太多時， 可將培養(yang) 角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為(wei) 止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yang) 液至另一新的培養(yang) 角瓶， 加入新鮮培養(yang) 基稀釋至適當濃度， 重複前述步驟即可。
 
11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為(wei) 多少轉速？
欲回收動物細胞， 其離心速率一般為(wei) 300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鍾， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。
 
12 細胞之接種密度為(wei) 何？ 依照星空体育官方网站首页基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
 
13 細胞冷凍培養(yang) 基之成份為(wei) 何？
動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yang) 基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yang) 基均勻混合之。注意：由於(yu) DMSO 稀釋時會(hui) 放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配製完成。
 
14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為(wei) 何？
冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為(wei) Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為(wei) 無菌狀況， *次開瓶後應立即少量分裝於(yu) 無菌試管中， 保存於(yu) 4°C， 避免反複冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 並可減少汙染之機會(hui) 。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。
15 冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置於(yu) 4 °C 30~60 分鍾→ (-20 °C30 分鍾*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲(chu) 存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置於(yu) 已設定程序之可程序降溫機中每分鍾降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲(chu) 存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
 
16 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nei) 應有多少細胞濃度？
冷凍管內(nei) 細胞數目一般為(wei) 1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為(wei) 宜。
 
17 應如何避免細胞汙染？ 細胞汙染的種類可分成細菌、酵母菌、黴菌、病毒和黴漿菌。主要的汙染原因為(wei) 無菌操作技術不當、操作室環境不佳、汙染之血清和汙染之細胞等。嚴(yan) 格之無菌操作技術、清潔的環境、與(yu) 品質良好之細胞來源和培養(yang) 基配製是減低汙染之方法。
 
18 如果細胞發生微生物汙染時，應如何處理？
直接滅菌後丟(diu) 棄之。
 
19 支原體(ti) (mycoplasma) 汙染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經驗之專(zhuan) 家外，大多數遭受支原體(ti) 汙染的星空体育官方网站首页，無法以其外觀分辨之。
 
20 支原體(ti) 汙染會(hui) 對細胞培養(yang) 有何影響？
支原體(ti) 汙染幾乎可影響所有細胞之生長參數， 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為(wei) mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義(yi) 。
 
21 偵(zhen) 測出星空体育官方网站首页有支原體(ti) 汙染時， 該如何處理？
直接滅菌後丟(diu) 棄，以避免汙染其它星空体育官方网站首页。
 
22 CO2 培養(yang) 箱之水盤如何保持清潔？
定期(至少每兩(liang) 周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
 
23 為(wei) 何培養(yang) 基保存於(yu) 4 °C 冰箱中， 顏色會(hui) 偏暗紅色， 且pH值會(hui) 越來越偏堿性？
培養(yang) 基保存於(yu) 4 °C 冰箱中， 培養(yang) 基內(nei) 之CO2 會(hui) 逐漸溢出，造成培養(yang) 基越來越偏堿性。而培養(yang) 基中之酸堿指示劑(通常為(wei) phenol red) 的顏色也會(hui) 隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yang) 基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yang) 基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。
 
24 各種細胞培養(yang) 用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 製造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。
 
25 購買(mai) 之細胞冷凍管經解凍後，為(wei) 何會(hui) 發生細胞數目太少之情形？
研究人員在冷凍細胞之培養(yang) 時出現細胞數目太少， 大都是因為(wei) 離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷(shang) ， 以及細胞流失。建議細胞解凍後不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜後再更換培養(yang) 基即可。
 
26 購買(mai) 之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細胞培養(yang) 時出現存活率不佳， 常見原因可歸納為(wei) ：培養(yang) 基使用錯誤或培養(yang) 基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍後， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為(wei) 死細胞。培養(yang) 溫度使用錯誤。細胞置於(yu) –80 °C 太久。
 
27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為(wei) 操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋鬆動或鬆脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞汙染，故冷凍管於(yu) 放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。